Introducción
⌅Garantizar
la seguridad alimentaria es una de las principales metas de los
servicios veterinarios, lo cual requiere un control eficaz de las
enfermedades infecciosas, especialmente aquellas que provocan pérdidas
significativas en especies animales de interés económico (11. FAO (2017). Políticas públicas y marcos institucionales para la agricultura.
).
Este control depende, en gran medida, de la capacidad para realizar un
diagnóstico rápido y confiable de los agentes etiológicos involucrados
en los brotes infecciosos (22.
Sánchez OP, Bermejo PM. Brotes [outbreaks], epidemias [epidemics],
eventos [events], and other epidemiological terms of daily usage.
Revista Cubana de Salud Pública. 2020;46(2):1-16.
).
En Cuba, las especies pertenecientes a la subfamilia Bovinae tienen un alto valor económico, por lo que la ganadería bovina constituye una prioridad estratégica, al representar uno de los principales patrimonios del país y la segunda rama de importancia económica nacional.
La eficiencia productiva del sector bovino se
ve comprometida por enfermedades reconocidas a nivel mundial, por su
impacto negativo en los bioindicadores productivos de estas especies,
algunas de ellas de elevada gravedad (33.
Almenarez Segura, W. Elementos para una estrategia de desarrollo
productivo sostenible con enfoque sistémico en una Unidad Empresarial de
Base Pecuaria. Revista Ciencia Universitaria. 2022;20(1). Recuperado a partir de https://revistas.unah.edu.cu/index.php/cu/article/view/1573
). Entre estas se encuentra la causada por el género Betacoronavirus, al cual pertenece el coronavirus bovino (BCoV), un agente que infecta
el tracto respiratorio y gastrointestinal del ganado bovino (44. Vlasova AN, Saif LJ. Bovine Coronavirus and the associated diseases. Front. Vet. Sci. 2021;8:293-307.
), así como de algunos rumiantes silvestres (55. Zhu Q, Li B, Sun D. Advances in Bovine Coronavirus Epidemiology. Viruses. 2022; 14(5):1109. https://doi.org/10.3390/v14051109. PMID: 35632850; PMCID: PMC9147158.
).
El BCoV se asocia con diversos síndromes clínicos, como la diarrea en
terneros, la disentería de invierno, caracterizada por diarreas
hemorrágicas en adultos y enfermedades respiratorias en animales de
distintas edades, incluyendo la fiebre de embarque (66.
Curiel M, Díaz C, Mesa D, Acevedo AM, Coronado L, Obret Y, Chávez G,
Perera, CL. Disentería de invierno asociada con el coronavirus bovino en
vacas de la provincia Mayabeque, Cuba. Rev Salud Anim. 2021;43(3).
).
Aunque la mortalidad asociada al virus suele ser baja, la infección por
BCoV induce una dramática reducción en la producción de leche en los
rebaños lecheros y un deterioro de las condiciones de salud del animal,
tanto en terneros como en el bovino adulto (77.
Cho HC, Kim Y, Cho YI, Park J, Choi KS. Evaluation of bovine
coronavirus in Korean native calves challenged through different
inoculation routes. Vet Res. 2024;55(1):74. https://doi.org/10.1186/s13567-024-01331-9. PMID: 38863015; PMCID: PMC11165853.
).
Las pérdidas económicas derivadas de la infección por BCoV no se
limitan a la mortalidad, sino que también incluyen los costos asociados a
servicios veterinarios, tratamientos y medicamentos (88.
Sarkar SL, Alam ASMRU, Das PK, Pramanik MHA, Al-Emran HM, Jahid IK,
Hossain MA. Development and validation of cost-effective one-step
multiplex RT-PCR assay for detecting the SARS-CoV-2 infection using SYBR
Green melting curve analysis. Sci Rep. 2022;12(1):6501. https://doi.org/10.1038/s41598-022-10413-7. PMID: 35444203; PMCID: PMC9019801.
).
La
disentería de invierno, considerada una enfermedad exótica y de baja
probabilidad de aparición en Cuba por su asociación con climas templados
(99.
Smith DR, Fedorka-Cray PJ, Mohan R, Brock KV, Wittum TE, Morley PS,
Hoblet KH, Saif LJ. Epidemiologic herd-level assessment of causative
agent and risk factors for winter dysentery in dairy cattle. Am J Vet
Res. 1998;59:986-993.
), se identificó por primera vez
en el país en 2004, mediante RT-PCR en punto final, a partir de
muestras fecales de vacas lecheras que padecieron la enfermedad (1010.
Barrera Valle M, Rodríguez Batista E, Betancourt Martell A, Frías
Lepuroux M T, Brandão P. Short communication. First report in Cuba of
bovine coronavirus detection in a winter dysentery outbreak. Span. J.
Agric. Res. 2006;4(3):221-224.
). Desde entonces, se han descrito en Cuba brotes estacionales de esta enfermedad (1111. Martínez N, Rodríguez M, Barrera M. New outbreaks of bovine coronavirus in dairies of Havana. Rev. Salud Anim. 2010;32:135.
).
Para
reducir el riesgo de diseminación del BCoV y aplicar medidas de control
más eficaces, es fundamental contar con ensayos de diagnósticos rápidos
y sensibles (1212.
OMSA. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico
de las enfermedades infecciosas. Manual Terrestre de la OMSA. 2023;1-18.
).
La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (rPCR) permite la
amplificación de secuencias de ácidos nucleicos con elevada
sensibilidad y especificidad. En comparación con la PCR convencional o
de punto final esta técnica ofrece un mayor rango dinámico, menor riesgo
de contaminación cruzada y cuantificación precisa de la carga viral (1313.
Rodríguez Rodríguez G, Rodríguez A, Ángel M, Herzberg Z, Alfonso Á.
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Mens Bioquím.
2021;45: 11-22.
). Estas ventajas han posicionado a la
rPCR o rRT-PCR, según sea el caso, como la herramienta de elección para
el diagnóstico de primera línea. No obstante, en Cuba aún no se dispone
de un ensayo diagnóstico con alta sensibilidad y especificidad para la
detección de BCoV, a pesar de ser ampliamente recomendado por numerosos
autores para la confirmación de casos clínicos (1414.
Pansria P, Katholma J, Kroghb KM, Aagaardc AK, Schmidtc LM, Kudirkienec
E, et al. Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of
pathogens associated with the bovine respiratory disease complex. The
Vet.J. 2020;256:1-9.
).
El objetivo de este estudio fue desarrollar un ensayo de rRT-PCR basado en SYBR Green I para la detección sensible y específica de BCoV.
Materiales y Métodos
⌅Virus
⌅Las cepas de referencia y aislados de campo empleados en este estudio se listan en la Tabla 1.
| Virus | Cepa de referencia/ Aislado viral | Fuente |
|---|---|---|
| BCoV | Kakegawa/ cepa | Instituto Pasteur, Sao Paulo, Brasil. |
| Herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) | E8/ aislado cubano | CENSA, Cuba |
| Virus de la diarrea viral bovina (BVDV) | NADL | CENSA, Cuba |
| Rotavirus bovino | G6 | Instituto de Investigaciones Agrícolas de Venezuela |
| Virus de la bronquitis infecciosa aviar | M43/ aislado cubano | CENSA, Cuba |
Propagación de virus
⌅Los aislados de campo y las cepas de BCoV, se cultivaron en la línea celular de riñón bovino (MDBK, de las siglas en inglés Madin Darby Bovine Kidney)
según los procedimientos estándares que se describen en el Manual de
Ensayos de Diagnósticos y Vacunas para Animales Terrestres (1212.
OMSA. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico
de las enfermedades infecciosas. Manual Terrestre de la OMSA. 2023;1-18.
).
Luego de 72 horas de incubación a 37ºC, los virus se colectaron
mediante tres ciclos de congelación-descongelación y se conservaron a
-70oC hasta ser usados para la extracción del ARN viral.
Procesamiento de las muestras
⌅En este estudio se emplearon muestras de heces de bovinos negativas a BCoV y se contaminaron con la cepa de referencia Kakegawa. El procesamiento de las muestras se realizó de la siguiente forma: se tomó 1 g de la muestra de heces y se diluyó en 9 mL de medio DMEM (Dulbecco´s Modidied Eagle Medium) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y se homogenizaron por agitación en vórtex durante 1 min. Estas suspensiones se centrifugaron a 12 000 g x 15 min, a 4oC. El sobrenadante colectado se filtró por una membrana de celulosa de 0,45 µm.
Métodos de extracción de ARN
⌅La extracción de ARN a partir de las heces contaminadas se realizó por el método propuesto por Casas et al. (1515.
Casas I, Powell L, Klapper PE, Cleator GM. New method for the
extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the
polymerase chain reaction assay. J Virolog Met.1995;53:25-36.
).
El precipitado obtenido se resuspendió en 10 μL de agua libre de
nucleasas (Promega, Madison, WI, USA) y se conservó a -80oC hasta su
evaluación.
Selección de cebadores
⌅Se utilizaron los cebadores descritos por Tsunemitsu et al. (1616.
Tsunemitsu H, Smith DR, Saif LJ. Experimental inoculation of adult
dairy cows with bovine coronavirus and detection of coronavirus in feces
by RT-PCR. Arch Virol. 1999;144(1):167-175.
) para la
detección de BCoV (cebador sentido: 5´-GCCGATCAGTCCGACCAATC-3´ y
cebador anti-sentido: 5´-AGAATGTCAGCCGGGGTAT-3´), que amplifican un
fragmento de 407 pb del gen de la nucleocápsida viral (1616.
Tsunemitsu H, Smith DR, Saif LJ. Experimental inoculation of adult
dairy cows with bovine coronavirus and detection of coronavirus in feces
by RT-PCR. Arch Virol. 1999;144(1):167-175.
). La Tm
del producto de amplificación se estimó con el empleo del paquete de
programas Oligo, versión 7 (Análisis Molecular de Biología, Inc., USA).
RT-PCR en tiempo real
⌅Todos los análisis de rRT-PCR se realizaron sobre el instrumento LightCycler® 2.0 (Roche AppliedScience, Mannheim, Germany). Se realizaron un grupo de experimentos para optimizar los protocolos que incluyeron concentraciones de reactivos y parámetros del termoperfil. La reacción de amplificación se realizó en un capilar de vidrio de 20 μL que contenía: 5 μL del ADN molde, 1 μL de cada uno de los cebadores sentido y anti-sentido para los cuales se evaluaron las siguientes concentraciones: 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5 μM; 2 μL de LightCycler® FastStart DNA master SYBR-Green I (10X) (Roche, Alemania), 8 μL de MgCl2 para lo cual se evaluaron las siguientes concentraciones: 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 y 5,5 mM y agua libre de nucleasa (Promega, Madison, WI, USA) para un volumen final de 20 μL en cada reacción. Adicional a esta mezcla se añadió 0,5 μL de la enzima reverso-transcriptasa SuperScript (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).
El termoperfil empleado fue el siguiente: 50ºC por 30 min, 95ºC por 10 min seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 95ºC por 10 s; se evaluaron tres temperaturas de alineamiento: 58, 60 y 62ºC por 10 s y elongación a 72ºC por 20 s con adquisición de dato fluorescente. Después de los ciclos de PCR, se generó una curva de disociación (0 s a 95ºC, 15 s a 65ºC, 0 s a 95ºC) para discriminar entre los amplicones específicos y los productos de amplificación no específicos. Los picos de disociación se visualizaron al graficar la primera derivada negativa de la fluorescencia contra la temperatura (−dF/dT versus T), lo cual se obtiene con el empleo del programa LightCycler® 4.05.415 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany). El valor de Tm se definió como el punto máximo de la curva.
Sensibilidad analítica
⌅Para determinar el límite de detección del ensayo se realizaron diluciones seriadas en base 10, en sobrenadantes de muestras fecales negativas con la cepa Kakegawa de BCoV con título infectivo de 106.0 TCID 50/mL. De cada dilución se extrajo el ARN viral que se empleó como molde para el ensayo de rRT-PCR. Cada dilución se evaluó por duplicado.
Se utilizaron las condiciones óptimas determinadas en los análisis anteriores.
Especificidad analítica
⌅Para la determinación de la especificidad analítica del ensayo se evaluaron ácidos nucleicos moldes provenientes de diferentes virus que causan un cuadro clínico similar al BCoV: herpesvirus bovino 1 (BoHV-1), rotavirus bovino, virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y otro virus relacionado estrechamente: el virus de la bronquitis infecciosa aviar (Tabla 1).
Repetibilidad
⌅La repetibilidad del ensayo de rRT-PCR basado en SYBR Green I se determinó con el empleo de tres muestras, una muestra positiva fuerte (105 TCID 50/mL), una muestra positiva media (103 TCID 50/mL) y una muestra positiva baja (102 TCID 50/mL). Las tres muestras se obtuvieron diluyendo la cepa Kakegawa de BCoV en sobrenadante de heces negativas a este virus. Para determinar la variabilidad intra-ensayo, cada dilución se evaluó por triplicado. Para medir la variabilidad inter-ensayo, cada dilución se evaluó en tres corridas diferentes realizadas por tres operadores diferentes en días diferentes. La desviación estándar (SD, de las siglas en inglés, standard deviations) se calculó con el programa LightCycler® 4.05.415 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) y el coeficiente de variación (CV) se determinó según la fórmula: CV = (SD [valor de Ct] / Media [valor de Ct]) x 100, de acuerdo con las guías consultadas (USA, Environmental Protection Agency, 2004).
Evaluación del desempeño diagnóstico del ensayo de rRT-PCR en muestras fecales
⌅Las muestras evaluadas procedían de cuatro provincias del país, obtenidas de bovinos de zonas afectadas por la enfermedad (Tabla 2). Las muestras se colectaron entre los meses de septiembre y octubre de 2020, para su posterior procesamiento. Además, se colectaron ocho muestras de una Vaquería Experimental, de animales que no presentaban diarreas. En total se colectaron 35 muestras fecales.
| Nombre de la unidad | Provincia | Número de muestras |
|---|---|---|
| U-1 | La Habana | 4 |
| U-2 | Mayabeque | 6 |
| U-3 | Mayabeque | 2 |
| U-4 | Villa Clara | 2 |
| U-5 | Villa Clara | 4 |
| U-6 | Villa Clara | 4 |
| U-7 | Cienfuegos | 5 |
| Total de muestras | 27 |
Colecta y procesamiento de las muestras fecales
⌅Las muestras fecales se colectaron en tubos estériles después de limpiar el área con papel toalla. Aproximadamente, 30 g de material fecal se colectó directamente del recto de los bovinos usando guantes de látex estériles. Las muestras se conservaron en neveras que contenían contenedores de hielo y se trasladaron a la Unidad de Diagnóstico de Virología Animal (UDVA) del CENSA donde se conservaron a -80oC hasta su procesamiento.
De
cada muestra fecal procesada se tomó 1g y se diluyó en 9 mL de medio
DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) con antibióticos [penicilina
(500 000 UI/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) estreptomicina
(0.5g/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y fungizona (5mg/mL)
(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)] y suero fetal
bovino al 10 % (GibcoTM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) (1717.
Seid U, Dawo F, Tesfaye A, Ahmednur M. Isolation and Characterization
of Coronavirus and Rotavirus Associated with Calves in Central Part of
Oromia, Ethiopia. Vet Medi.Int. 2020:1-10.
).
Seguidamente, las muestras se homogenizaron por agitación durante un
minuto en vórtex y se clarificaron en una centrífuga Eppendorf 5427 a 12
000 g 15 min a 4oC. El sobrenadante se filtró por una membrana de acetato de celulosa de 0.45 μm (Centrisart, Sartorius) y se conservó a -80oC hasta se evaluación.
Evaluación de las muestras
⌅Las
muestras fecales colectadas se evaluaron por el nuevo ensayo de RT-PCR
en tiempo real basado en SYBR Green I, por la técnica de aislamiento
viral (AV) y por la PCR en punto final descrito por Tsunemitsu et al. (1616.
Tsunemitsu H, Smith DR, Saif LJ. Experimental inoculation of adult
dairy cows with bovine coronavirus and detection of coronavirus in feces
by RT-PCR. Arch Virol. 1999;144(1):167-175.
).
Aislamiento viral
⌅Se utilizaron células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK), que se mantuvieron en medio DMEM (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) con un 10% de suero fetal bovino (GibcoTM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a una concentración final de 0,5%. La inoculación se realizó como se detalla a continuación: se emplearon placas de 24 pozos con una monocapa confluente con una concentración de células de 3,5 x105 células/mL en medio DMEM suplementado con penicilina-estreptomicina 100 UI-μg/mL y con 5 % de suero fetal bovino (GibcoTM Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), certificado libre de virus y micoplasmas). Se retiró el medio de cultivo de los pozos y se adicionó 200 μL de las muestras fecales procesadas para aislamiento viral. Después de la adsorción a 37°C durante 1 hora, las células se lavaron tres veces con PBS y se adicionaron 800 μL de medio de mantenimiento DMEM sin suero fetal y se incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO2. Las placas se observaron diariamente durante cinco días. Tanto las muestras que presentaron efecto citopático (EC) como las que tenían ausencia del mismo, se congelaron y descongelaron tres veces. Se realizó un pase sucesivo siguiendo el mismo procedimiento descrito con el primer pase. Pasados cinco días de incubación el sobrenadante de cada muestra se cosechó (realizando tres congelaciones y descongelaciones) y se conservó a -80ºC en alícuotas de 0,5 mL, para su posterior evaluación por el ensayo de RT-PCR en punto final.
Detección del genoma por RT-PCR en punto final
⌅Se realizó la extracción de ARN por el método propuesto por Casas et al. (1515.
Casas I, Powell L, Klapper PE, Cleator GM. New method for the
extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the
polymerase chain reaction assay. J Virolog Met.1995;53:25-36.
).
El segmento de 407 pb del gen de la nucleocápsida de BCoV se amplificó
mediante un ensayo de RT-PCR en punto final. La reacción de
amplificación se realizó en un volumen final de 50 μL que contenía: 25
μL de 1x GoTaq Green Master Mix [200 μM de cada dNTP, 1.5 mM MgCl2 (pH 8.5)] (Promega, Madison, WI, USA), 0,5 μM de los cebadores sentido y
antisentido (5´-GCCGATCAGTCCGACCAATC-3´ / 5´-AGAATGTCAGCCGGGGTAT-3´)
propuestos por Tsunemitsu et al. (1616.
Tsunemitsu H, Smith DR, Saif LJ. Experimental inoculation of adult
dairy cows with bovine coronavirus and detection of coronavirus in feces
by RT-PCR. Arch Virol. 1999;144(1):167-175.
), 5 μL
de cada ADNc y 19 μL de agua libre de nucleasas (Promega, Madison, WI,
USA). La reacción de PCR se realizó en un termociclador (Eppendorf,
Mastercycler) bajo las siguientes condiciones: 94ºC durante 4 min,
seguida por 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 1 min,
alineamiento a 58ºC por 1 min y extensión a 72ºC por 2 min. La extensión
final se realizó a 72ºC por 7 min.
Detección del genoma por el nuevo ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR Green I desarrollado
⌅La reacción de amplificación se realizó con las condiciones que se establecieron durante la estandarización del ensayo.
Resultados y Discusión
⌅Se
ha documentado que los ensayos de rPCR requieren una adecuada
optimización, cuando esto no ocurre sólo alcanzan valores de eficiencia
de amplificación que no superan el 75 % (1818.
Bialek K, Czajka M, Bialas W, Juszczuk- Kubiak E. Optimization of
quantitative PCR reaction conditions for the study of gene expresión in
lactic acid bacteria. Scientific Reports. 2021; 11, (1): 23581. http://doi.org/10.1038/s41598-021-02987-5.
).
Para evitar estos inconvenientes es imprescindible realizar una precisa
y certera optimización de los parámetros de la reacción que incluyen
tanto los involucrados con el sistema (componentes críticos de la
reacción de PCR) como los del entorno termodinámico (1919.
Lowe AJ, Jones AE, Ray S, Wall M. PCR primer design and reaction
optimization. En M. A. Williams (Ed.), PCR. 2017: 33-48. Humana Press. http://doi.org/10.1007/978-1-4939-7060-51_2.
).
Un
punto clave para la optimización de los ensayos de PCR lo constituye la
extracción del ácido nucleico y el tipo de muestra a partir de la cual
se realizará su detección. Se necesita emplear una metodología capaz de
rendir ADN o ARN de calidad y cantidad suficiente para desarrollar la
PCR, reduciendo al mínimo las sustancias que puedan inhibirla. En este
estudio, el ensayo de rRT-PCR se optimizó para la detección del BCoV en
muestras fecales. En general, las heces constituyen una matriz compleja
para el diagnóstico, ya que las sustancias inhibidoras que siempre están
presentes en las heces pueden interferir en la reverso transcripción o
en la amplificación, dando como resultado una muestra falsa negativa (2020.
Asano KM, Souzaa SPD, De Barros IN, Ayres GR, Silva SOS, Richtzenhaina L
J, et al. Multiplex semi-nested RT-PCR with exogenous internal control
for simultaneous detection of bovine coronavirus and group A rotavirus.
J. Virolog. Met.2010; 169(2):375-379.
). El método de extracción de ácido nucleico utilizado fue el propuesto por Casas et al., 1995, desarrollado específicamente para heces fecales, un tipo de
muestra con alto contenido de inhibidores y que ha demostrado eficacia
en su remoción en estudios previos (1515.
Casas I, Powell L, Klapper PE, Cleator GM. New method for the
extraction of viral RNA and DNA from cerebrospinal fluid for use in the
polymerase chain reaction assay. J Virolog Met.1995;53:25-36.
).
Otro elemento de gran importancia en la reacción lo constituye la pareja de cebadores utilizados. Los cebadores seleccionados amplifican una región de 407 pb que abarcan desde el nucleótido 92 hasta el 480 del gen de la nucleocápsida del BCoV. La evaluación in sílico de los cebadores seleccionados mostró valores altos de eficiencia de hibridación (P.E) (478 < P.E < 555). Estos resultados se obtuvieron a partir de la fórmula de la P.E del programa Oligo (Rychlik y Rychlik, 2000), que cuantifica la probabilidad de que un oligonucleótido dado se hibride en un sitio determinado en la secuencia molde. La eficiencia de hibridación en este estudio se estimó con 54 secuencias.
En todos los casos se obtuvieron valores de P.E superiores a 210; se conoce que valores superiores a esta magnitud provocan una hibridación adecuada durante la reacción de PCR, mientras que valores inferiores, pudieran resultar en una falsa hibridación o en la ausencia de esta. Estos resultados indican que los cebadores seleccionados presentan un alta P.E frente a todas las secuencias de BCoV obtenidas del GenBank.
Con el empleo del programa Oligo versión 7.0 se obtuvo además la Tm específica teórica para el amplicón resultante de este ensayo, con valor de 84,9 °C; la cual puede tener una diferencia de un grado con la temperatura in vitro. Las diferencias que pudieran existir entre las Tm teóricas y las in vitro están fundamentadas por la contribución de los iones Mg2+ en el medio, así como de los monocationes y dNTPs libres, parámetros que por lo general son subestimados por lo programas de evaluación de cebadores.
Las reacciones basadas en la detección de SYBR Green I
están por lo general sesgadas por el hecho de que se detecta, además,
la amplificación de dímeros de cebadores durante el curso de la reacción
(2121.
Silva TL, Cargnelutti JF, Weiblen R, Flores EF. Evaluation of
primer-probe sets for SYBR green I-based real-time RT-PCR detection of
bovine coronavirus in fecal simples. Brazilian Journal of Microbiology.
2022;53(1):345-354.
). Por esta razón se deben
discriminar, con una elevada precisión, las amplificaciones específicas
de aquellas que no lo son. Para cumplir este objetivo, en 1996 Roche
Applied Science incorporó en el programa LightCycler® el cálculo de la segunda derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (2222.
Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, David DA, Gundry RA, Balis UJ. The
LightCycler ™: A Microvolume Multisample Fluorimeter with Rapid
Temperature Control. BioTechniques. 1997;22:176-181.
)
lo que facilitó la discriminación y cuantificación de los productos
obtenidos con SYBR Green I sin la necesidad de utilizar sondas
específicas (2323.
Ririe K, Rasmussen RP, Wittwer CT. Product differentiation by analysis
of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Analytical
Biochemestry. 1997;245:154-160.
). A partir de este
momento el análisis de resolución de curvas de disociación ha formado
parte indispensable en los ensayos de rPCR basados en SYBR Green I (2424.
Acevedo AM, Martínez N, Brandão P, Perera CL, Frías MT, Barrera M, et
al. Phylogenetic and molecular characterization of coronavirus affecting
species of bovine and birds in Cuba. Biotecnol Apl. 2013;30(3):228-231.
).
Por este motivo un elemento de gran importancia es conocer la Tm
específica teórica para el amplicón resultante de la pareja de cebadores
que se va a emplear en un ensayo.
La temperatura de alineamiento
(Ta) de los cebadores al molde de ADN es el primer parámetro a ajustar
entre las variables de la reacción de PCR (2525.
Wang L, Zhang H, Zhou M. Optimization of anneling temperaturein a
one-step SYBR Green RT-PCR for sensitive detection of bovine
coronavirus. Molecular and Cellular Probes. 2023;68:100190.
),
la cual está directamente relacionada con la Tm. Esta a su vez, está
determinada por el número y la composición de bases de los
oligonucleótidos, en particular por el porcentaje de bases GC del total.
La expresión más aceptada por la comunidad científica para predecir la
temperatura óptima de alineamiento de los cebadores al molde es la
fórmula de Rychlik (Expresión 1).
Expresión 1:
Leyenda:
Ta es la temperatura óptima de alineamiento, Tm de los cebadores es la
temperatura de disociación de los cebadores, Tm del producto es la
temperatura de disociación del producto amplificado y los términos
restantes son constantes a concentraciones fijas de los componentes de
la reacción (2626.
Costa AM, Santos RV, Lima MT. A SYBR Green I RT-qPCR assay with melting
temperature analysis for specific detection of bovine coronavirus in
fecal samples. Brazilian Journal of Microbiology. 2023;54(2):987-995.
).
La temperatura de alineamiento (Ta) predicha por el modelo teórico fue de 58°C. Tras evaluar experimentalmente tres temperaturas cercanas a este valor (58°C, 60°C y 62°C) con diluciones seriadas del molde, el análisis de las curvas de disociación determinó que la Ta óptima para este ensayo fue de 60°C.
El resultado de Ta óptima de 60ºC experimental con relación al cálculo teórico, puede ser el resultado del ΔG de la reacción y de las condiciones de optimización del ensayo que influyen en este parámetro como son la concentración de los cebadores, del catión monovalente y de magnesio libre en la reacción que se fijan para el cálculo teórico de Ta. Este resultado indica que la temperatura óptima del ensayo debe seleccionarse experimentalmente, aunque puede ser orientada por cálculos teóricos.
Finalmente, las concentraciones de cebadores y MgCl2 establecidas en este ensayo fueron 0,2 µM y 3 mM, respectivamente. La mezcla del PCR final contenía 0,2 µM de cada cebador, 2 µL de FastStart DNA Master SYBR Green I (8µL de MgCl2 25 mM) (concentración final de 3 mM), 5 µL del ADN molde; la temperatura óptima de alineamiento seleccionada fue de 60oC (Fig. 1).
Sensibilidad analítica por dosis infectiva
⌅En
la evaluación de la sensibilidad analítica a partir de diluciones
seriadas en base 10 en sobrenadante de muestras fecales negativas a
BCoV, el límite de detección del ensayo de rRT-PCR basado en SYBR Green I
fue 103.0 TCID 50/mL (Fig. 2).
A pesar de que la muestra clínica constituye una matriz compleja con
inhibidores de la PCR, la sensibilidad analítica alcanzada en este
estudio es similar a la reportada por otros ensayos en tiempo real (2727.
Pansria P, Katholma J, Kroghb KM, Aagaardc AK, Schmidtc LM, Kudirkienec
E, et al. Evaluation of novel multiplex qPCR assays for diagnosis of
pathogens associated with the bovine respiratory disease complex. The
Vet J. 2020;256: 1-9.
). Sin embargo, este valor
demuestra la elevada sensibilidad analítica de los ensayos de rPCR que
garantizan la detección del agente aún en cargas virales muy bajas (2828.
Johnson RP, Smith TG, Davis KL. Analytical validation of a real-time
RT-PCR assay for bovine coronavirus: determination of limit of detection
using infectiousvirus titers. J Vet Res. 2023;67(2):245-253.
).
De este modo, el ensayo optimizado define como resultado positivo la combinación de tres criterios: 1) un Ct inferior a 35, 2) una curva de amplificación con incremento exponencial, y 3) una curva de disociación con un pico único a 85 ± 1 °C, característico del BCoV.
El ensayo también resultó ser específico, ya que solo se obtuvo una curva de amplificación con un valor de temperatura de disociación de 850C con la cepa Kakegawa del BCoV. El ensayo no amplificó el ácido nucleico del resto de los virus evaluados, que son virus homólogos y heterólogos que afectan al bovino como el herpesvirus bovino 1, el virus de la diarrea viral bovina y el rotavirus bovino, así como un virus estrechamente relacionado genéticamente como el virus de la bronquitis infecciosa aviar.
El ensayo de rRT-PCR desarrollado demostró una
alta repetibilidad, con coeficientes de variación (CV) intra-ensayo de
0.5-1.2% e inter-ensayo de 1.4-2.1%. Ambos rangos cumplen con los
criterios de aceptación preestablecidos (CV < 2% para intra-ensayo y
< 3% para inter-ensayo) (1212.
OMSA. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico
de las enfermedades infecciosas. Manual Terrestre de la OMSA. 2023;1-18.
).
Estos resultados validan la robustez del método y sustentan su utilidad
como herramienta de diagnóstico en la práctica clínica (1212.
OMSA. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico
de las enfermedades infecciosas. Manual Terrestre de la OMSA. 2023;1-18.
).
Evaluación del desempeño diagnóstico del ensayo de rRT-PCR en muestras fecales
⌅Evaluación de las muestras por aislamiento viral
⌅De las 35 muestras fecales procesadas mediante cultivo celular, se obtuvieron 12 aislamientos viables (34.3 %), los cuales fueron identificados como BCoV mediante RT-PCR de punto final. Cabe destacar que se logró aislar el virus en muestras procedentes de todas las unidades afectadas, abarcando las diferentes provincias del estudio.
La
multiplicación viral se evidenció por la observación del EC
característico de este virus al quinto día después de la inoculación (Fig. 3).
El EC inicialmente se manifestó como un efecto focal de redondeamiento
celular, que más tarde se extendió afectando toda la monocapa celular y
donde además se observaban células redondeadas. Entre las 72 a 96 horas
después de la inoculación se observó que la mayor parte de la monocapa
se desprendía, coincidiendo con lo descrito por Seid et al. (1717.
Seid U, Dawo F, Tesfaye A, Ahmednur M. Isolation and Characterization
of Coronavirus and Rotavirus Associated with Calves in Central Part of
Oromia, Ethiopia. Vet Medi.Int. 2020:1-10.
) para este
virus. Las células empleadas como controles permanecieron sin
alteraciones durante el tiempo de observación, por lo que las
alteraciones descritas se atribuyeron a la presencia de BCoV.
La
identidad de los aislamientos obtenidos se confirmó por el ensayo de
RT-PCR en punto final, donde en todos los casos se obtuvo el fragmento
de la talla esperada de 407 pb con el empleo de los cebadores
específicos (1616.
Tsunemitsu H, Smith DR, Saif LJ. Experimental inoculation of adult
dairy cows with bovine coronavirus and detection of coronavirus in feces
by RT-PCR. Arch Virol. 1999;144(1):167-175.
), diseñados a partir del gen que codifica la proteína de la nucleocápsida de BCoV.
Pese a la reconocida dificultad del aislamiento primario del BCoV en cultivo celular para fines diagnósticos rutinarios (2929. Hodnik JJ, Ježek J, Starič J. Coronaviruses in cattle. Trop Anim Health Prod. 2020;52(6):2809-2816.
),
su realización sigue siendo imprescindible. Esto se debe a dos razones
principales: primero, para obtener cepas de tipo salvaje necesarias en
investigación (estudios virológicos, antigénicos y moleculares); y
segundo, para generar los paneles de muestras requeridos en los ensayos
de validación, ya que el aislamiento viral sigue siendo la técnica de
referencia en virología (1212.
OMSA. Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico
de las enfermedades infecciosas. Manual Terrestre de la OMSA. 2023;1-18.
).
Competencia del ensayo con muestras clínicas
⌅La competencia del nuevo ensayo de rRT-PCR desarrollado, para la detección de BCoV en muestras clínicas, se evaluó por el análisis de 35 muestras fecales que se comparó con el ensayo de RT-PCR en punto final y el aislamiento viral (Tabla 3).
| Provincia | Unidad | AV | RT-PCR en punto final | rRT-PCR (Ct) |
|---|---|---|---|---|
| La Habana | U-1 | Negativo | Positivo | 30,64 |
| Positivo | Positivo | 25,68 | ||
| Negativo | Negativo | 34,10 | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Mayabeque | U-2 | Positivo | Positivo | 26,26 |
| Positivo | Positivo | 22,45 | ||
| Negativo | Positivo | 30,62 | ||
| Positivo | Positivo | 23,66 | ||
| Negativo | Negativo | 33,58 | ||
| Positivo | Positivo | 25,88 | ||
| U-3 | Positivo | Positivo | 25,85 | |
| Negativo | Positivo | 30,76 | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| Villa Clara | U-4 | Negativo | Negativo | 34,76 |
| Positivo | Positivo | 22,36 | ||
| U-5 | Positivo | Positivo | 27,13 | |
| Positivo | Positivo | 31,42 | ||
| Negativo | Negativo | 33,34 | ||
| Negativo | Negativo | Negativo | ||
| U-6 | Negativo | Positivo | 32,9 | |
| Positivo | Positivo | 28,94 | ||
| Negativo | Positivo | 32,65 | ||
| Positivo | Negativo | Negativo | ||
| Cienfuegos | U-7 | Positivo | Positivo | 27,45 |
| Negativo | Positivo | 31,86 | ||
| Negativo | Positivo | 31,73 | ||
| Negativo | Negativo | 32,55 | ||
| Positivo | Positivo | 26,66 | ||
| P/T | 12/27 | 19/27 | 24/27 | |
| % Positivos | 44,4 | 70,4 | 88,9 |
P/T: Total de muestras positivas por esa técnica/Total de muestras procedentes de animales con síntomas clínicos.
Un total de 24 muestras fueron positivas a BCoV por el nuevo ensayo rRT-PCR desarrollado, para un 88,9 % de positividad de las muestras evaluadas. Sin embargo, sólo 12 muestras (44,4 %) fueron positivas por AV y 19 muestras fueron positivas por RT-PCR en punto final (70,4 %).
Todas
las muestras positivas por AV se detectaron por el nuevo ensayo de
rRT-PCR desarrollado. Sin embargo, 12 muestras positivas por rRT-PCR
escaparon a la detección por AV (falsos negativos). Este hecho, pudiera
estar sustentado por dos razones, en primer lugar, porque el AV puede
fallar ante cargas virales bajas (3030.
Pérez LJ, Díaz De Arce H, Tarradas J, Rosell R, Perera CL, Muñoz M, et
al. Development and validation of a novel SYBR Green real-time RT-PCR
assay for the detection of classical swine fever virus evaluated on
different real-time PCR platforms. J Virol Met. 2011;174(1-2):53-59.
) y en segundo lugar porque está descrito por varios autores que el AV resulta difícil para este virus (2929. Hodnik JJ, Ježek J, Starič J. Coronaviruses in cattle. Trop Anim Health Prod. 2020;52(6):2809-2816.
).
Las 12 muestras a partir de las cuales se obtuvieron los aislados
presentaron valores de Ct inferiores a 29 por el ensayo de rRT-PCR, lo
cual sugiere que el AV sólo es exitoso en muestras donde está presente
una carga viral media o alta (3131.
Delgado LG, Marrero-Perera R, Báez LC, López YH, Acevedo AM, Vento DR.
et al. Ensayo de PCR en tiempo real basado en SYBR-Green I para la
detección de herpesvirus bovino tipo 1. Rev Salud Anim. 2019;41(3):1-10.
).
Resultados similares a los obtenidos en este estudio fueron publicados por Martínez et al. (3232.
Martínez A, Silva S, Caballero M, Pichardo M, Cortés R, Bonilla JL, et
al. Jornada de Investigación en Ganadería de la Leche, 26-27 de enero de
2016. Memorias.
), donde de 103 muestras de heces
evaluadas para coronavirus bovino por ensayo de RT-PCR en punto final
fueron detectados en 73 muestras positivas para un 88 % de positividad y
solo obtuvieron 10 aislamientos. Hansa et al. (3333.
Hansa A, Rai RB, Dhama K, Wani MY, Saminathan M, Ranganath GJ.
Isolation of Bovine Coronavirus (BCoV) in vero cell line and its
confirmation by direct FAT and RT-PCR. Pakitan J Biol Science.
2013;16(21):1342-1347.
) identificaron 101 muestras
fecales procedentes de terneros con diarreas con menos de tres meses
edad, confirmadas como positivas por un kit de antígeno de ELISA
comercial, de las cuales sólo 15 muestras fueron positivas por
aislamiento viral.
De igual forma, todas las muestras positivas
por el ensayo de RT-PCR en punto final se detectaron por el nuevo ensayo
rRT-PCR desarrollado y ninguna de las muestras informadas como
negativas por el ensayo de tiempo real resultaron positivas por el
método de RT-PCR en punto final. Solo cinco muestras positivas por
rRT-PCR escaparon a la detección por el ensayo de PCR en punto final
(falsos negativos). Es de señalar que todas estas muestras tenían cargas
virales bajas con valores de Ct que oscilaban entre 32 y 35. Este
resultado demuestra una vez más que el rRT-PCR es más sensible que el
RT-PCR en punto final, debido a que tiene un amplio rango dinámico que
le permite detectar cantidades mínimas de la muestra, aún aquellas que
presenten bajas cargas virales (menos de cinco copias). Esto a su vez
hace posible que se puedan analizar tamaños de muestra muy pequeños, ya
que se requieren 1000 veces menos cantidad de ARN que el PCR en punto
final (3434.
Kralik P, Ricchi M. A basic guide to real time PCR in microbial
diagnostics: definitions, parameters, and everything. Front Microbiol.
2017;8:108-117.
). Esta característica, junto a que
esta técnica combina los pasos de amplificación del ADN y de detección
al mismo tiempo, sin necesidad de tener que requerir de geles de agarosa
para detectar los productos amplificados, constituyen dos de las
ventajas más importantes de este nuevo ensayo.
La diferencia
encontrada en cuanto al elevado número de muestras positivas detectadas
por los ensayos basados en la PCR, en particular con el nuevo ensayo
desarrollado, con respecto al AV justifican que estos ensayos hayan
desplazados al AV como “estándar de oro” para muchas enfermedades
virales. De ahí, que Hoffmann et al. (3535.
Hoffmann B, Beer M, Reid SM, Mertens P, Oura CA, Rijn PAV, et al. A
review of RT-PCR technologies used in veterinary virology and disease
control: sensitive and specific diagnosis of five livestock diseases
notifiable to the World Organisation for Animal Health. Vet Microbiol
2009;139(1-2):1-63.
) propongan los ensayos de rPCR
como el ensayo de referencia para varias enfermedades virales que
afectan animales de interés económico.
La elevada sensibilidad
analítica, la especificidad, así como la repetibilidad y el desempeño
del ensayo obtenido en el presente estudio sobre las muestras clínicas,
lo convierten en una herramienta útil para la detección rápida y certera
de BCoV. Sin embargo, teniendo en cuenta lo descrito por Pérez et al. (3636.
Pérez LJ, Díaz De Arce H, Cilloni F, Salviato A, Marciano S, Perera CL,
et al. An SYBR Green-based real-time RT-PCR assay for the detection of
H5 hemagglutinin subtype avian influenza virus. Mol Cell Prob.
2012;26:137-145.
) quien plantea que uno de los
aspectos críticos de los ensayos de rPCR es la necesidad de su continua
validación y monitoreo sobre cepas representativas de las especies
circulantes y su desempeño en diferentes matrices, se hace necesario su
evaluación en muestras de exudado rectal y nasal, para demostrar el uso
del mismo en el diagnóstico de BCoV cuando se esté presentando
sintomatología respiratoria, aspecto que será abordado en estudios
posteriores.
Conclusiones
⌅La rapidez y el alto rendimiento del ensayo de rRT-PCR desarrollado proporciona una herramienta poderosa para el diagnóstico de la infección por BCoV en Cuba. Este ensayo proporciona un buen desempeño analítico con elevada sensibilidad y especificidad para la detección de BCoV en muestras fecales, con una sensibilidad superior al AV y PCR en punto final en muestras clínicas fecales.