Los Culicoides son dípteros hematófagos. Aproximadamente el 96% de las especies se alimentan de sangre de vertebrados, principalmente de mamíferos e incluso de seres humanos; de ahí que desempeñan un papel importante en la transmisión de patógenos virales y parasitarios de interés veterinario y para la salud pública (11. Meiswinkel R, Elbers, AR. The dying of the light: crepuscular activity in Culicoides and impact on light trap efficacy at temperate latitudes. Medical and Veterinary Entomology. 2016; 30: 53-63.
, 22. Kessinger P, James AM, Magzamen S, et al. Habitat suitability analysis for Culicoides species implicated in bluetongue virus transmission in the Southeastern United States. Med Vet Entomol. 2024;38(4):e12786. doi: http://doi.org/10.1111/mve.12786.
). Se han aislado de Culicoides spp. más de 50 arbovirus de importancia en medicina veterinaria, entre los que se destacan (a) el virus de la lengua azul (VLA); (b) la enfermedad hemorrágica epizoótica (VEHE); (c) la peste equina africana (PEA); (d) la estomatitis vesicular (VEV) y (e) Schmallenberg (SBV), cuya distribución geográfica se va incrementando debido al cambio climático y al calentamiento global, generando la emergencia o reemergencia de estos agentes virales (33. Hunter P. Climate change and waterborne and vector-borne disease. J Appl Microbiol. 2003; 94: 37-46.
-66. Catania AM, Grego E, Tomassone L, et al. Silent circulation of Bluetongue and Schmallenberg viruses in Culicoides biting midges in northwestern Italy: implications for the 2024 BTV outbreak. J Med Entomol. 2025;62(6):1582-9. doi: http://doi.org/10.1093/jme/tjaf128.
). Para la salud humana tienen gran importancia como vectores del virus de Oropouche (OROV).

En Cuba, García (77. García I. Insectos hematófagos de Cuba. Poeyana.1976; 154: 1-20.
) informó que la familia Ceratopogonidae está representada por alrededor de siete especies conocidas de “jejenes”. Las más importantes son Culicoides furens y Leptoconops becquaerti, ambas de hábitats costeros. La primera está distribuida a lo largo de todas las costas cubanas, mientras la segunda está limitada a las costas de las regiones central y oriental de Cuba. Ambas especies causan gran molestia al hombre y a los animales que viven cerca de las costas. Además, se describen otras especies de Culicoides como Culicoides barbosai (88. Wirth WW, FS Blanton. Biting midges of the genus Culicoides from Panama (Diptera, Heleidae). Proc. U.S. Nat. Mus. 1959; (3415),109:237-482.
), Culicoides gorgasi (99. Wirth WW, Blanton FS. Studies in Panama Culicoides (Diptera, Heleidae) III. A new species related to phlebotomus (Williston). Entomological News. 1953; 64: 113-120.
), Culicoides hoffmani (1010. Fox I. A review of the species of biting midges of Culicoides from the Caribbean Region (Diptera: Ceratopogonidae). Ann. Ent. Soc. Amer. 1946; 39: 248-258.
), Culicoides insignis y Culicoides pusillus (1111. Lutz A. Contribuicao para 0 estudo das Ceratopogoninas hematofagas do Brasil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1913; 5: 45-73.
).

La identificación taxonómica de los miembros del género Culicoides se ha basado, casi exclusivamente, en el patrón de manchas alares, genitalia de machos y hembras, y caracteres observables en los palpos y antenas (88. Wirth WW, FS Blanton. Biting midges of the genus Culicoides from Panama (Diptera, Heleidae). Proc. U.S. Nat. Mus. 1959; (3415),109:237-482.
, 1212. Spinelli GR, Ronderos MM, Díaz F, Marino P. The bloodsucking biting midges of Argentina (Diptera: Ceratopogonidae). Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 2005; 100: 137-150.
, 1313. Borkent A, Spinelli GR. Biodiversidad Acuática en América Latina. Neotropical Ceratopogonidae (Diptera: Insecta). 2007; 4: 1-200.
). Debido a la similitud morfológica que presentan algunas especies de este género, y que comúnmente son simpátricas, es fundamental contar con métodos alternativos que refuercen los datos aportados por las claves taxonómicas para la identificación de Culicoides (1414. Stephan A, Clausen PH, Bauer B, Steuber S. PCR identification of Culicoides dewulfi midges (Diptera: Ceratopogonidae), potential vectors of bluetongue in Germany. Parasitology Research. 2009; 105:367-371.
). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos para este género, unido a la secuenciación del genoma ofrece una posibilidad de reforzar el proceso de identificación de los Culicoides (1515. Zhang S, Chen Z, Xiao L, Wang J. Development of a nested PCR assay-based molecular identification and genetic analysis of common Culicoides species in Fujian Province. Chin J Parasitol Parasit Dis. 2025;43(3):403-8. doi: http://doi.org/10.12140/j.issn.1000-7423.2025.03.015.
, 1616. Mosquera JD, Zapata S, Augot D. Culicoides insignis in Ecuador: Molecular identification of blood meals and detection of bluetongue virus. Curr Res Parasitol Vector Borne Dis. 2025;8:100288. doi: http://doi.org/10.1016/j.crpvbd.2025.100288.
).

En Cuba, existen reportes de especies costeras de Culicoides (77. García I. Insectos hematófagos de Cuba. Poeyana.1976; 154: 1-20.
), pero no se han realizado estudios recientes en sistemas ganaderos que incluyan la confirmación molecular. El objetivo del presente trabajo fue identificar las especies del género Culicoides presentes en granjas bovinas de la región occidental de Cuba, mediante técnicas morfológicas y moleculares.

Para la captura y colección de los Culicoides se seleccionaron tres granjas bovinas situadas en la región occidental de Cuba (La Habana y Mayabeque) donde se habían identificado previamente diferentes serotipos del VLA (1717. Acevedo AM, Postic L, Curiel M, Gondard M, Bréard E et.al. Detection, Characterization and Sequencing of BTV Serotypes Circulating in Cuba in 2022. Viruses. 2024; 16: 164. doi: https://doi.org/10.3390/v16010164.
) (Tabla 1).

Las capturas de Culicoides se realizaron con trampas de aspiración tipo CDC, dotadas de una fuente de luz ultravioleta (Miniature CDC Light Trap, EE.UU.), entre los meses de octubre a noviembre de 2024 con una frecuencia de tres días seguidos en cada granja. Cada día, desde las 18:00 horas hasta las 06:00 horas del día siguiente, se colocaron tres trampas en distintos puntos de las unidades bovinas en una ubicación en forma de triángulo, a una altura entre 1.50 y 2 metros por encima del suelo y a una distancia de 1 a 5 metros del lugar donde se encontraban los rebaños. Los especímenes se preservaron en etanol al 70%.

La identificación morfológica se realizó en el laboratorio del CRVC de la UMR-ASTRE del CIRAD de Guadalupe, donde se procedió a separar los dípteros pertenecientes a la familia Ceratopogonidae del resto de los insectos. Posteriormente, se realizó la clasificación de los ejemplares del género Culicoides basado en la observación de caracteres morfológicos como el patrón de manchas alares, genitalia y caracteres observables en los palpos y antenas (88. Wirth WW, FS Blanton. Biting midges of the genus Culicoides from Panama (Diptera, Heleidae). Proc. U.S. Nat. Mus. 1959; (3415),109:237-482.
, 1212. Spinelli GR, Ronderos MM, Díaz F, Marino P. The bloodsucking biting midges of Argentina (Diptera: Ceratopogonidae). Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 2005; 100: 137-150.
, 1313. Borkent A, Spinelli GR. Biodiversidad Acuática en América Latina. Neotropical Ceratopogonidae (Diptera: Insecta). 2007; 4: 1-200.
). Se utilizó la clave dicotómica del patrón alar descrita por Perruolo (1818. Perruolo G. Clave de las especies de Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) asociadas con la ganadería en la región neotropical. Rev Cient FCV-LUZ. 2009;19(2):124-33.
).

Con el fin de elaborar preparaciones microscópicas, los ejemplares de Culicoides se diseccionaron y las diferentes estructuras (alas, cabeza, tórax y abdomen) se colocaron en láminas porta objetos con medio EUPARAL y se observaron bajo la lupa binocular (OPTIKA, Zeiss) y la lupa binocular de mayor resolución Leica (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania).

La identificación molecular se efectuó mediante extracción de ADN genómico con estuche comercial QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) a partir de las patas y tórax de los Culicoides previamente identificados y la amplificación del gen COI con cebadores universales (1919. Simon CF, Frati A, Beckenbach B, Crespi H, Lui, P Flook. Evolution, weighing and phylogenetic unity of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Ann. Entomol. Soc. Am. 1994; 87: 651-701.
). Se evaluaron dos variantes de PCR (Variante 1 y 2). En la primera (Variante 1) la mezcla de reacción contenía un volumen final de 25 µL, con 2.5 µL de Buffer de reacción 10X, MgCl₂ 2mM, dNTPs 0,8 mM, cebador sentido y antisentido 0,2 µM, Taq DNA polimerasa 1 U/µL (Invitrogen, EE.UU.) y agua libre de nucleasas hasta completar el volumen final (Promega Corporation, Madison,WI, USA). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, seguido por 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 50°C y 30 s a 72°C cada uno, con una extensión final de 7 min a 72°C. Se añadió un volumen de 1 µL de ADN genómico en la reacción de PCR y se incluyó un control negativo. La electroforesis se realizó en un gel de agarosa al 2% y los productos de amplificación se visualizaron utilizando un marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen, EE.UU.). En la segunda variante (Variante 2) se realizaron algunos cambios en la concentración final de MgCl₂ (3 mM), se añadieron 1.5 µL en la mezcla de reacción y se añadieron 2 µL de ADN molde. Además, Se evaluaron dos programas de PCR, una Variante A: estándar, con una temperatura de alineamiento de 50°C y una Variante B: Touchdown, en la que todo fue similar a la Variante A, excepto en el programa donde se introducen 8 ciclos de 45°C- 49°C en la etapa del alineamiento.

De las 18 muestras analizadas se identificaron dos especies, Culicoides insignis y Culicoides hoffmani, presentes en granjas bovinas de La Habana y Mayabeque. La identificación morfológica fue clara mediante el patrón de manchas alares. Se hicieron preparaciones microscópicas de 10 muestras representativas de cada granja.

En la identificación molecular, los resultados de PCR de la Variante 1 no fueron significativos, solo se observó una banda muy poco definida en una muestra (2.3b, correspondiente al macerado de pata y tórax), el resto de las 17 muestras fueron negativas (datos no mostrados).

En la Variante 2 de PCR, se evaluaron las 18 muestras. En la Figura 1 (Variante A y B) se muestra una representación de algunas de las muestras evaluadas. La Variante A mostró baja eficiencia, mientras que la Variante B (Touchdown) permitió amplificación exitosa en todas las muestras.

La presente investigación constituye la primera evidencia morfológica y molecular en el estudio de los Culicoides asociados a la ganadería bovina en la región occidental de Cuba.

La identificación de dos especies, Culicoides insignis y Culicoides hoffmani, en las provincias de La Habana y Mayabeque representa un hallazgo relevante, ya que ambas especies han sido reportadas previamente en la literatura, pero no en el contexto de sistemas productivos bovinos cubanos ni mediante confirmación molecular.

La identificación morfológica basada en el patrón de manchas alares, siguiendo la clave de Perruolo (1818. Perruolo G. Clave de las especies de Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae) asociadas con la ganadería en la región neotropical. Rev Cient FCV-LUZ. 2009;19(2):124-33.
), permitió discriminar con claridad ambas especies. Este resultado reafirma la utilidad de las claves taxonómicas tradicionales, especialmente cuando se aplican por personal entrenado y con acceso a equipos ópticos adecuados. No obstante, la similitud morfológica entre especies simpátricas del género Culicoides justifica plenamente el uso complementario de herramientas moleculares, como se planteó en esta investigación (2020. Dähn O, Werner D, Mathieu B, Kampen H. Large Scale Cytochrome C Oxidase Subunit I Gene Data Analysis for the Development of a Multiplex PCR Test Capable of Identifying Biting Midge Vector Species and Haplotypes (Diptera: Ceratopogonidae of the Culicoides Subgenus Avaritia Fox, 1955. Genes. 2024; 15(3):323. doi: http://doi.org/10.3390/genes15030323.
, 2121. Sena da Silva SL, Sena do Nascimento BL, da Silva FS, Damous Díaz D, Da Silva, LH, et al. Diversity and molecular identification of Culicoides Latreille 1809 in a mining complex in the southeastern region of the Brazilian Amazon. Acta Tropica. 2026; 278:108060. doi: http://doi.org/10.1016/j.actatropica.2026.108060).
).

En cuanto a la identificación molecular, la optimización de las condiciones de la PCR fue un paso crucial. La variante B del protocolo (Touchdown PCR) resultó ser la más eficiente, permitiendo la amplificación exitosa del gen mitocondrial COI en todas las muestras evaluadas, mientras que la variante estándar fue poco eficiente. Este resultado es coherente con estudios previos (2222. Hebert PDN, Cywinska A, Ball y De Waard JR. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 2003;270: 313-21.
, 2323. Ander M, Troell K, Chirico J. Barcoding of biting midges in the genus Culicoides: a tool for species determination. Medical and Veterinary Entomology. 2012; 27(3): 323-331.
), que destacan la robustez del gen COI como marcador universal para la identificación específica mediante códigos de barras genéticos (2424. Jin T, Husseneder C, Foil L. Assigning Culicoides larvae to species using DNA barcoding of adult females and phylogenetic associations. Parasit Vectors. 2022;15:349. doi: http://doi.org/10.1186/s13071-022-05479-1.
-2727. Springer Nature. Chromosome-scale genome of Culicoides brevitarsis provides a resource for vector biology. BMC Genomics. 2023; 24:112.
).

La presencia de Culicoides insignis en las granjas estudiadas reviste especial interés, dado su papel reconocido como vector del VLA en la región neotropical (1313. Borkent A, Spinelli GR. Biodiversidad Acuática en América Latina. Neotropical Ceratopogonidae (Diptera: Insecta). 2007; 4: 1-200.
, 1616. Mosquera JD, Zapata S, Augot D. Culicoides insignis in Ecuador: Molecular identification of blood meals and detection of bluetongue virus. Curr Res Parasitol Vector Borne Dis. 2025;8:100288. doi: http://doi.org/10.1016/j.crpvbd.2025.100288.
, 2828. Tanya VN, Greiner EC, Gibbs EPJ. Evaluation of Culicoides insignis (Diptera: Ceratopogonidae) as a vector of bluetongue virus. Veterinary microbiology. 1992; 32(1): 1-14.
). Este hallazgo, en combinación con antecedentes serológicos de VLA en bovinos cubanos (2929. Martínez N, Alfonso A, Barrera M. Primer reporte de bovinos seroreactores al virus de la lengua azul en Cuba. Rev. Salud Anim. 2011; 33: 131-133.
) y la reciente detección y caracterización molecular de doce serotipos del VLA presentes en bovinos y ovinos de la región occidental de Cuba (1717. Acevedo AM, Postic L, Curiel M, Gondard M, Bréard E et.al. Detection, Characterization and Sequencing of BTV Serotypes Circulating in Cuba in 2022. Viruses. 2024; 16: 164. doi: https://doi.org/10.3390/v16010164.
), refuerza la necesidad de implementar sistemas de vigilancia entomológica y virológica que permitan monitorear la circulación de éste y otros arbovirus de importancia veterinaria (3030. Thabet S, Lajnef RR. Potential mechanisms underlying bluetongue virus emergence and spread. Front Virol. 2024; 4:1448192. doi: http://doi.org/10.3389/fviro.2024.1448192.
, 3131. McGregor BL, McDermott EG. Advancing knowledge on Culicoides biting midges, vectors of medical and veterinary importance. J Med Entomol. 2026;63(2):tjag044. doi: http://doi.org/10.1093/jme/tjag044.
).

En Cuba, la detección de Culicoides paraensis en áreas urbanas (3232. Martínez Pérez Y, Companioni Ibáñez A, Menéndez Z, et al. First report of Culicoides paraensis in Cuba: A new challenge for public health. Parasite Epidemiol Control. 2025; 29:e00423. doi: http://doi.org/10.1016/j.parepi.2025.e00423.
) confirma la necesidad de la vigilancia, no solo en escenarios productivos sino también de salud pública.

Por su parte, Culicoides hoffmani, aunque menos estudiado, ha sido reportado en otras regiones del Caribe y podría tener un papel vectorial aún no caracterizado, lo que subraya la importancia de su inclusión en estudios de competencia vectorial.

La detección de nuevas especies en Cuba y el Caribe (3232. Martínez Pérez Y, Companioni Ibáñez A, Menéndez Z, et al. First report of Culicoides paraensis in Cuba: A new challenge for public health. Parasite Epidemiol Control. 2025; 29:e00423. doi: http://doi.org/10.1016/j.parepi.2025.e00423.
, 3333. Holcomb KM, Dunford JC, Connelly CR. Estimated suitability distribution for Culicoides paraensis in the contiguous Uinted States and Caribbean territories. J Med Entomol. 2026; 63(2):tjag038. doi: http://doi.org/10.1093/jme/tjag038.
) confirma que la diversidad de Culicoides en la región está subestimada y requiere estudios continuos.

Este trabajo también demuestra la factibilidad de aplicar técnicas moleculares en condiciones locales, utilizando protocolos estandarizados y equipamiento accesible. Aunque las secuencias aún están pendientes de análisis, la obtención de productos amplificables constituye un avance metodológico significativo para futuras investigaciones.

La experiencia adquirida en este estudio sienta las bases para el desarrollo de capacidades nacionales en taxonomía molecular de vectores.