Los patógenos de las plantas continúan siendo factor limitante para los rendimientos agrícolas y reducen significativamente la productividad a nivel mundial, causando serios problemas para la seguridad y sostenibilidad alimentaria. En particular, las especies virales del género Begomovirus de la familia Geminiviridae, provocan severos y devastadores daños en cultivos de importancia económica como hortalizas, fibras y tubérculos, con una amplia diversidad molecular y distribución en zonas tropicales y subtropicales de todo el planeta (11. Barboza N, Martínez Zubiaur Y. Begomoviruses in crops with economic interest for North and Central América. En: RK Gaur, Pradeep Sharma, Henery Czosnek (Eds). Geminivirus: Detection, Diagnosis and Management. Academic Press, ISBN 9780323905879; 2022. p.125-137.
).

A medida que aumenta la demanda mundial de producción de alimentos en un contexto de clima cambiante, la aplicación de la nanotecnología podría mitigar, de manera sostenible, muchos desafíos en el manejo de enfermedades en humanos, animales y plantas, mejorando las vías de administración de fármacos y productos químicos y biológicos, promoviendo la detección rápida de patógenos y contribuyendo a las transformaciones genéticas (22. Elmer W, White JC. The future of Nanotechnology in Plant Pathology. Annual Review of Phytopathology. 2018; 56:1, 111-133.
, 33. Marwal A, Gaur RK. Nanophytovirology: An Emerging Field for Disease Management. En: Snježana Topolovec-Pintarić (Ed). Plant Diseases-Current Threats and Management Trends. 2019. Disponible en: http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.86653 p 220.
). En los últimos años se explora su potencial en la detección de patógenos en plantas, como herramientas de diagnóstico rápido, para la detección de bacterias, hongos y nematodos y, en menor medida, para enfermedades virales; emergiendo esta tecnología como una herramienta potencial para mejorar la sensibilidad, precisión y rapidez de la identificación de patógenos, con métodos más rápidos, económicos y precisos (44. Verma N, Shukla M, Kulkani R, Pandya A. Emerging Extraction and Diagnostic Tools for Detection of Plant Pathogens: Recent Trends, Challenges, and Future Scope. ACS Agricultural Science & Technology. 2022; 2(3). DOI: https://doi.org/10.1021/acsagscitech.2c00150
, 55. Shivashakarappa K, Reddy V, Tupakula VK, Farnian A, Vuppula A, Gunnaiah R. Nanotechnology for the detection of plant pathogens, Plant Nano Biology. 2022; 2: 100018, ISSN 2773-1111.
).

La extracción de ácidos nucleicos es uno de los pasos fundamentales en las aplicaciones de biología molecular, es un requisito previo para muchos experimentos y constituye un punto crítico para el desempeño de los métodos de diagnóstico e identificación de patógenos en humanos, animales y plantas dado que su calidad afecta, directamente, los resultados de la detección posterior (66. Paul R, Ostermann E, Wei Q. Advances in point-of-care nucleic acid extraction technologies for rapid diagnosis of human and plant diseases. Biosensors and Bioelectronic. 2020; 169: 112592. ISSN 0956-5663, https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112592
, 77. OMNI International Blog. Accelerating Nucleic acid extraction in agriculture. 2024. Disponible en: www.blog.omni-inc.com/tag/nucleic-acid-extraction
, 88. Chen Y, Liu Y, Shi Y, Ping J, Chen H. Magnetic particles for integrated nucleic acid purification, amplification and detection without pipetting. Trends in Analytical Chemistry 127. 2020; 115912.
).

Los métodos tradicionales de extracción de ácidos nucleicos requieren mucho tiempo, son laboriosos, y los operarios deben poseer capacitación, lo cual hace que el uso de las tecnologías emergentes, como la separación magnética, ofrezcan una serie de ventajas entre las que destacan el reducido tiempo de procesamiento, la ausencia de reactivos químicos tóxicos, la facilidad en la separación y automatización, además de la separación de ADN de contaminantes y desechos celulares. Las perlas magnéticas (MB) se consideran una herramienta poderosa para la extracción de ácidos nucleicos y utilizan los principios del magnetismo para el aislamiento eficiente de suspensiones biológicas. El acoplamiento de propiedades magnéticas con ligandos específicos en MB, permite la separación y purificación de ácidos nucleicos de una forma altamente eficiente y específica. Esta técnica ha impulsado una revolución tecnológica en la investigación biológica (88. Chen Y, Liu Y, Shi Y, Ping J, Chen H. Magnetic particles for integrated nucleic acid purification, amplification and detection without pipetting. Trends in Analytical Chemistry 127. 2020; 115912.
, 99. Singh R, Kuddus M, Kumar PS, Choden D. Nanotechnology for Nanophytopathogens: From Detection to the Management of Plant Viruses. BioMed Research International. 2022, Article ID 8688584, 12 Pages. Disponible en: https://doi.org/10.1155/2022/8688584
)

Durante la pandemia de COVID-19, se dedicaron esfuerzos a lograr métodos que permitieran realizar purificaciones de ARN, masivas, eficaces y con disminución del tiempo dedicado a este paso y, ante esta necesidad, el Centro de Estudios Avanzados de Cuba, desarrolló el sistema de extracción magnética CEA-NANO⁺ RNA 3.0 (1010. CEA-NANO⁺ RNA 3.0. Sistema de extracción magnética de ARN a partir de muestras biológicas. Instrucciones para el uso. REV.04-01/2023. Disponible en: . https://www.cea.cu/wp-content/uploads/2024/07/Instructivo-Ed.04-01-2023-1.pdf
), con resultados satisfactorios para la purificación de ARN en el diagnóstico de SARS-CoV-2, que fuera registrado, posteriormente, por los órganos reguladores del país (1111. Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED). Ámbito Regulador. RESOLUCIÓN No. 43/2024. Disponible en: https://www.cecmed.cu/vigilancia/equipos-medicos/alertas/comunicacion-fabricante-012022-instrucciones-uso-ipu . Consultado Diciembre 2024.
).

El objetivo del presente estudio fue el uso del juego de nanopartículas magnéticas CEA-NANO⁺ RNA 3.0, para la extracción de ácidos nucleicos a partir de material vegetal foliar.

Para este estudio se utilizaron tres plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) con síntomas de begomovirus a las cuales se le realizó extracción de ADN según el protocolo de CTAB (1212. Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 1987. 19, 11-15.
) y con el sistema de nanopartículas magnéticas, acorde al instructivo de uso del juego de reactivos CEA-NANO+ RNA 3.0 (1010. CEA-NANO⁺ RNA 3.0. Sistema de extracción magnética de ARN a partir de muestras biológicas. Instrucciones para el uso. REV.04-01/2023. Disponible en: . https://www.cea.cu/wp-content/uploads/2024/07/Instructivo-Ed.04-01-2023-1.pdf
), con modificaciones en el proceso inicial de homogenización del material vegetal, realizándose a partir de 1 g de material foliar de tomate infectado macerado en 0,3 ml de PBS pH 7 estéril. Seguidamente se colectaron 0,2 ml de la suspensión y se mezclaron con la solución de lisis-unión (SLU-RNA3.0) del juego de reactivo CEA-NANO+ RNA 3.0 y 0,1 ml de NESP-A380. El resto del procedimiento se realizó según el instructivo de uso de fabricante (1010. CEA-NANO⁺ RNA 3.0. Sistema de extracción magnética de ARN a partir de muestras biológicas. Instrucciones para el uso. REV.04-01/2023. Disponible en: . https://www.cea.cu/wp-content/uploads/2024/07/Instructivo-Ed.04-01-2023-1.pdf
).

La amplificación de los ADN obtenidos, de ambos métodos, se realizó con los cebadores genéricos AV494/AC1048 (1313. Wyatt SD, Brown J. Detection of Subgroup III Geminivirus Isolate in leaf extract by Degenerate Primers and Polymerase Chain Reaction. Phytopathology. 1996; 86, p 1288-1293.
) acorde al protocolo estándar para diagnóstico genérico de begomovirus (1414. EPPO. PM 7/152 (1) Begomoviruses, Standard on Diagnostics. EPPO Bulletin. 2022; 52:643-664. Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/epp.12887
). Como control positivo, se utilizó ADN de planta de tomate infectada, con el aislado cubano del virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV), especie Begomovirus coheni (1515. Roumagnac P, Ascencio-Ibanez, J, Lette JM et al. Rename 520 species (Geplafuvirales: Geminiviridae). International Committee on Taxonomy of Viruses. 2025. Disponible en : https://ictv.global/taxonomy/taxondetails?taxnode_id=202403484&taxon_name=Begomovirus%20coheni#release_35
), del banco de ADN controles del laboratorio de Virología Vegetal y Molecular del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria. Como control negativo, se utilizó ADN extraído por el método de nanopartículas magnéticas, a partir de grelos de papa infectadas con Pectobaterium carotova y un control del proceso de PCR (mezcla de PCR sin ADN molde).

En la figura 1 se observa el fragmento de ADN amplificado en las tres muestras de campo, con el tamaño esperado de aproximadamente 580 pb, coincidente con el fragmento obtenido de la extracción con CTAB. Se observó que, en la extracción con CTAB, la amplificación fue obtenida solo en la dilución 1/10 a partir del ADN obtenido; mientras que, con el juego CEA-NANO⁺ RNA 3.0, se obtuvo amplificación en diluciones 1/10 y 1/20. La especificidad diagnóstica fue adecuada, dado que no se observó amplificación en los controles negativos utilizados.

La cuantificación de ADN se dificulta, con la extracción mediante nanopartículas, debido a que se obtiene en una misma extracción ARN y ADN totales, y para lograr esta cuantificación sería necesario insertar un paso de tratamiento con RNAse o DNAse de acuerdo al propósito (1616. Berensmeier S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Appl Microbiol Biotechnol. 2006; 73:495-504.
).

El análisis de la sensibilidad analítica o límite de detección, a partir de las diluciones del ADN de la muestra 1 (Tabla 1) evidenció que, con la extracción de CEA-NANO⁺ RNA 3.0, es posible detectar begomovirus en plantas sintomáticas hasta diluciones de 1/100, con una adecuada sensibilidad.

Los resultados muestran la factibilidad del uso de este juego de reactivos, para la extracción de ADN viral, a partir de material foliar de plantas de tomate con adecuada sensibilidad y especificidad analítica y confirma las potencialidades de las nanopartículas funcionales para el desarrollo de metodologías rápidas y sensibles para la detección de patógenos de plantas, permitiendo la caracterización de begomovirus en chile y tomate (1717. Lavanya R, Arun V. Detection of Begomovirus in Chilli and Tomato Plants Using Functionalized Gold Nanoparticles. Sci Rep. 2021; 9;11(1):14203. Disponible en: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-145079/v1
). Se demuestra que el juego de diagnóstico CEA-NANO⁺ RNA 3.0 puede ser utilizado para la extracción de ADN a partir de tejido vegetal, con resultados satisfactorios y constituye una alternativa rápida y sensible para implementar protocolos de detección, recomendándose su evaluación para la detección de otros patógenos de plantas.